Forekomsten af variation i længden af DNA fragmenter der er produceret efter cleavage med en type II begrænsning endonuklease. Forskelle i DNA længder er tilstedeværelse eller fravær af anerkendelse kvadratnetsreference for denne særlige restriktionsenzym. RFLPs blev oprindeligt påvises ved hjælp af hybridisering med DNA-sonder efter adskillelse af fordøjede genomisk DNA ved gelelektroforese (sydlige analyse). Nu de opdages typisk ved elektroforese af fordøjede PCR-produktet.